Pharmacritique

[Note d'Elena Pasca: Voici la deuxième partie de l’exposé du Dr Didier Levieux, à lire en continuité avec la première, parue sur cette page, et avec les autres articles consacrés à divers aspects de l’affaire des héparines chinoises (conflits d’intérêts des experts des autorités sanitaires avec Sanofi-Aventis, au sujet des héparines (Lovenox : énoxaparine) ; le cas du lanceur d’alerte Jacques Poirier ; la pétition et la campagne de soutien organisée par la Fondation Sciences Citoyennes ; une bibliographie très riche pour ceux qui veulent en savoir plus, etc. Retour au texte de Didier Levieux :]

10.3.2 Contrôle de l'héparine en cours de purification (héparine "brute")

Deux types de contaminants sont recherchés :

1) des contaminants (ADN, protéines) pouvant servir à caractériser l'espèce animale à l'origine de l'héparine

2) le dermatan sulfate et de la chondroïtine persulfatée.

10.3.2.1 Détection de contaminants spécifiques d'espèce :

10.3.2.1.1 Recherche de fragments d'ADN spécifiques d'espèce

Cette recherche s'effectue par PCR (Polymerase Chain Reaction), c'est-à-dire par amplification de séquences d'ADN cibles présentes à l'état de trace. Leur "photocopie" répétée, grâce à des "amorces" et à un système enzymatique (Taq polymérase), multiplie le nombre d'exemplaire jusqu'à ce qu'elles puissent être mises en évidence par migration électrophorétique.

Deux difficultés majeures rendent délicate la PCR dans son application à l'héparine :

- l'ADN est fortement dégradé durant le procédé de purification de l'héparine et cette dégradation dépend du procédé utilisé. La technique a donc été progressivement améliorée chez Sanofi-Aventis par l'amplification de séquences relativement courtes (amplicons de 90 paires de bases) et présentes de façon répétées (ADN satellite).

- l'héparine est un inhibiteur très puissant de la PCR. Pour ne conserver que l'ADN contaminant, différents procédés ont été testés, dont l'extraction de l'héparine.Toutefois, l'élimination complète de l'héparine est difficile, et les analystes de Sanofi-Aventis reconnaissent, en 2008 (Houiste et al, 2008) que dans leurs mains il n'a pas été possible d'obtenir un rendement reproductible. Ils utilisent donc maintenant une autre voie d'approche : la digestion enzymatique de l'héparine (incubation pendant 12 heures avec un mélange d'héparinases I et II). Toutefois, ces enzymes peuvent être inhibées par les glycosaminoglycanes persulfatés ou d'autres substances (Anger, 2010).

La recherche d'ADN pour caractériser l'espèce d'origine a par ailleurs de sérieuses limites :

- les amorces permettant la réalisation de la PCR ne sont pas disponibles dans le commerce ; elles sont la propriété de l'industriel et jalousement gardées. La technique utilisée par un industriel ne peut donc être validée par les autorités dans l'un de ses laboratoires ou pratiquée par d'autres industriels.

- l'ADN n'est pas spécifique de tissu ou d'organe : la contamination par un poil ou une squame cutanée de bovin donnera une réponse positive pour un risque sanitaire nul. D'où des risques de fausses contaminations dans les ateliers qui préparent l'héparine brute et la nécessité de faire les analyses dans des laboratoires hautement spécialisés, protégés de toute contamination inter-échantillons, ou amenée par les techniciens.

- surtout, la recherche d'ADN contaminants ne peut détecter de l'héparine bovine ou ovine que s'il reste, justement, des contaminants. Or, le niveau de contaminants est très variable selon les héparines brutes. Par exemple, leur couleur varie du brun chocolat au blanc plâtre, selon le soin apporté au procédé et à la maîtrise des différentes étapes de la purification. Ainsi une héparine bovine "brute" provenant d'Amérique du Sud, par exemple, peut ne contenir aucun fragment d'ADN. Une héparine "brute", "propre" pourra cependant contenir du prion, car celui-ci est beaucoup plus résistant que l'ADN au procédé de fabrication

Pour pallier à cet écueil, l'industriel valide uniquement les lots d'héparine sur lesquels de l'ADN porcin est trouvé, signifiant ainsi que l'héparine est bien "brute". On comprendra aisément qu'il suffit d'ajouter une trace d'ADN porcin (quelques soies de porc...) dans une héparine bovine relativement purifiée pour rendre l'échantillon « conforme » : présence d'ADN de porc, donc héparine "brute" propre à la poursuite des analyses, et absence d'ADN de bovin.

10.3.2.1.2 Recherche de protéines spécifiques d'espèce

Des travaux conduits à l'INRA dans le cadre d'un co-financement par Aventis-Pharma, ont mis en évidence une protéine (aprotinine) qui n'existe que chez les bovins. De plus, cette protéine est synthétisée par les mêmes cellules que celles qui synthétisent l'héparine (mastocytes). Enfin, cette protéine de petite taille et résistante aux traitements thermiques, a une charge électrique très positive. De ce fait, elle est libérée de ces cellules étroitement associée à l'héparine (elle-même chargée très négativement), d'où les difficultés rencontrées par les chercheurs pour la caractériser (Rivera et al, 2002a,b). Ces qualités en font une cible parfaite pour dépister l'héparine bovine, et l'équipe INRA a donc développé une technique ELISA (Enzyme Linked Immunosorbent Assay) pour son dosage (Levieux et al, 2001).

Les dosages de type ELISA sont couramment utilisés dans tous les laboratoires d'analyses, en médecine humaine ou vétérinaire. Ils permettent de détecter des anticorps contre divers agents pathogènes ou les agents pathogènes eux-mêmes (bactéries, virus, prion...) ; ils sont également utilisés pour doser des marqueurs biologiques, des hormones, des pesticides, etc. La technique publiée par l'INRA (Levieux et al, 2001a) permet de détecter 5 parties d'intestin de bovin dans 1.000.000 de parties d'intestin de porc.

Les essais comparatifs effectués en 1999 lors de sa mise au point ont montré que cet ELISA était 30 à 300 fois plus sensible que la PCR (selon le type d'amorce utilisé pour la PCR par Aventis-Pharma). La technique est infiniment plus simple que la PCR et non sujette à des contaminations autres que par des cellules mastocytaires de bovins, cellules que l'on trouve majoritairement dans les tissus d'où on extrait l'héparine : intestin et poumon. Elle est donc plus fiable. Aventis-Pharma a néanmoins préféré développer sa PCR en interne, et la technique ELISA n'a donc pas été commercialisée. Elle est quand même appliquée actuellement par la Société IDBiotech sur simple demande de la part des industriels ou des autorités sanitaires.

Dans la même démarche, l'INRA a développé parallèlement des tests ELISA pour détecter les contaminants porcins, ovins et caprins (Levieux et al, 2001b).

Bien entendu, comme pour la recherche d'ADN, la sensibilité de la détection de ces tests ELISA est très dépendante du niveau de purification de l'héparine, et la technique ne pourra jamais déceler une héparine bovine relativement purifiée.

[Note d’Elena Pasca: cette présentation et explication scientifique richement documentée et référencée, daté du 20 octobre 2010, fait partie des documents rassemblés sur le site de la Fondation Sciences Citoyennes, qui a mené une campagne de soutien (coordonnée par moi, Elena Pasca) au lanceur d’alerte Jacques Poirier. Puisque les documents sont dans un grand fichier PDF téléchargeable, donc plus difficiles d’accès, Didier Levieux m’a demandé de reprendre cette présentation sur Pharmacritique, afin de compléter, par cet exposé scientifique, les articles déjà parus sur le blog, dans la catégorie « Héparines chinoises, Lovenox°, prion, chondroïtine », et accessibles à partir de cette page. A noter que le Dr Levieux a déjà publié sur Pharmacritique un article édifiant intitulé « Jacques Poirier et les héparines de Sanofi : "conflit de travail" ou sécurité sanitaire négligée ? »]

Par le Dr Didier Levieux

Directeur de recherches honoraires à l’INRA

1. L'héparine : indications, mode d'action, structure

2. La production d’héparine

3. La commercialisation de l'héparine en France

4. L'importance économique de l'héparine pour Sanofi-Aventis

5. L'importance économique des héparines chinoises

6. Le problème de la sécurité des matières premières d'origine chinoise

7. Les conséquences de l'encéphalite spongiforme bovine (ESB)

8. Le risque d'encéphalopathie spongiforme transmissible (EST)

9. Les "Matériaux à Risque Spécifié", la liste actuelle

10. Les possibilités de sécurisation de l’héparine

10.1 Qualité des sources de matières premières et leur traçabilité

10.2 Capacité du procédé de fabrication à inactiver le prion

10.3 Contrôles analytiques

10.3.1. Contrôle de la matière première princeps : la muqueuse intestinale

10.3.2 Contrôle de l'héparine en cours de purification (héparine "brute")

10.3.2.1. Détection des contaminants spécifiques d'espèce

10.3.2.1.1. Recherche de fragments d'ADN spécifiques d'espèce

10.3.2.1.2. Recherche de protéines spécifiques

10.3.2.2. Recherche de contaminants polysaccharidiques

10.3.3 Contrôle de l'héparine pure

11. La contamination de l'héparine par la chondroïtine persulfatée

11.1 Les accidents mortels aux Etat-Unis

11.2 Chondroïtine sulfate, chondroïtine persulfatée ?

11.3 L'origine de la contamination : la filière chinoise

11.4 La toxicité de la chondroïtine persulfatée

12. Aux Etats-Unis, le Congrès s'inquiète

13. Où en est-on aujourd'hui? Une évolution inquiétante de la Pharmacopée européenne et française

Par le Dr Didier LEVIEUX, directeur de recherches honoraire à l’INRA

En marge d’un débat du 10 janvier 2011 sur La chaîne parlementaire, le député Gérard BAPT a affirmé en "off" à un journaliste que l'affaire qui oppose actuellement le Dr Jacques POIRIER à SANOFI-AVENTIS serait un simple "conflit de travail" entre employeur et employé, et non un problème de sécurité sanitaire concernant un produit phare de la société: une héparine de bas poids moléculaire (énoxaparine) extraite de l'intestin de porc, commercialisée sous l'appellation Lovenox® ou Clexane®. Le député serait arrivé à cette conclusion après avoir reçu une lettre du Dr Poirier et recoupé les informations qu'elle contenait auprès du directeur scientifique de Sanofi-Aventis.

Décidément, l'histoire se répète : la sécurité sanitaire des produits d'origine biologique n'est toujours pas le principal souci des responsables politiques ou des administrations concernées par les produits pharmaceutiques. Or l'histoire de la sécurité sanitaire de l'héparine est de la même veine que celle de l'hormone de croissance : une matière première en quantité limitante qui pousse l'industriel à compléter ses approvisionnements chez des fournisseurs douteux, faisant courir aux patients le risque de contracter l'agent de maladie de Creutzfeldt-Jakob ("vache folle" chez les bovins).

[L'image illustre un article du Wall Street Journal daté du 21/02/20008: "Making Heparin is a Dirty Job"].

J'avais déjà adressé en 2003 un courrier [1] à Claude SAUNIER, sénateur des Côtes d'Armor, lui résumant mes interventions auprès des experts et autorités compétentes pour les alerter sur les problèmes de sécurisation sanitaire des héparines et leur relative inefficacité. Ce courrier est resté sans réponse, et aujourd'hui, dans un contexte où certaines dérives de l'industrie pharmaceutique apparaissent au grand jour, on voudrait de nouveau jeter un voile pudique sur l'affaire "Poirier" en affirmant tout simplement qu'il s'agit d'un "conflit de travail"…

Il serait préférable pour la sécurité sanitaire des citoyens que cela soit la vérité ; mais, témoin externe de cette affaire - et sans aucun lien d'intérêt - je peux hélas affirmer que le Dr Poirier a simplement payé très cher ses exigences sur la sécurité de l'héparine.

En effet, directeur de recherches dans un organisme de recherche publique, j'ai été amené à développer sur sa demande des méthodes de contrôle de la qualité des matières premières utilisées pour la production de l'énoxaparine en pleine période de "vache folle". Au cours de cette collaboration, j'ai pu observer de près le fonctionnement d'une grande industrie pharmaceutique et découvrir que business et sécurité sanitaire ne font pas toujours bon ménage.

J'ai été également spectateur du rôle ambigu joué par l'expertise du risque infectieux lié à l'énoxaparine, avec un conflit d'intérêt patent qui explique clairement le rôle de représentant de commerce d'un leader d'opinion. J'ai été sidéré de voir une politique de sécurisation menée plus sur des arguments financiers que scientifiques et de voir mis en exergue, comme garantie de sécurité, des éléments qui n'en sont pas : efficacité théorique du procédé à éliminer le prion (résultats considérés comme difficiles à interpréter selon tous les textes officiels publiés par les experts européens), technique de contrôle de l'origine animale de la matière première très sensible selon les chiffres fournis, mais véritable passoire…

Et le dossier n'est pas clos : pour assurer des approvisionnements en quantité suffisante, la possibilité d'utiliser l'intestin de bovin est ouverte, même si en Europe il n'est pas possible d'en acheter un mètre dans les abattoirs pour cause de risque de... prion ! On pourrait en sourire si d'autres pays, comme la Chine qui produit plus de 50% de l'héparine mondiale, n'étaient pas moins regardants et n'avaient une politique sanitaire moins rigoureuse.

Voir la suite de l'article pour les arguments, les références et le texte intégral de la lettre au sénateur Saunier.